Na czym polega test RT-PCR?
RT-PCR to metoda wykrywania materiału genetycznego, czyli kwasu nukleinowego patogenu. W przypadku wirusów zawierających RNA, takich jak SARS-CoV-2, badanie obejmuje dwa główne etapy: przepisanie RNA na DNA oraz powielenie wybranych fragmentów tego DNA. Aparat mierzy powstający sygnał w czasie rzeczywistym, dlatego pełna nazwa metody to rRT-PCR, czyli real-time reverse-transcription PCR.
Test nie wykrywa przeciwciał i nie pokazuje bezpośrednio, jak organizm zareagował na zakażenie. Różni się więc od badania serologicznego, które ocenia odpowiedź immunologiczną. RT-PCR sprawdza, czy w pobranym materiale znajduje się określona sekwencja genetyczna badanego patogenu.
Metodę można stosować w diagnostyce różnych drobnoustrojów. Rodzaj próbki, sposób jej pobrania i kryteria interpretacji zależą od konkretnego testu. Poniżej opisano typowy przebieg badania z materiału oddechowego, na przykład w kierunku SARS-CoV-2. Nie każdy szybki test molekularny jest klasycznym laboratoryjnym testem RT-PCR.
Jak pobiera się próbkę do badania?
Przed analizą personel pobiera materiał zgodnie z instrukcją właściwą dla danego zestawu diagnostycznego. Może to być wymaz z nosa lub nosogardła, wymaz z gardła, plwocina albo inny materiał oddechowy dopuszczony w danym protokole. Nie ma jednej techniki pobrania odpowiedniej dla wszystkich testów.
Przy wymazie pracownik medyczny używa jałowej wymazówki i wprowadza ją w miejsce wskazane w procedurze. Następnie obraca ją lub przesuwa w określony sposób, aby zebrać materiał, po czym umieszcza ją w pojemniku transportowym. Pobranie może wywołać łzawienie, odruch kaszlu lub krótkotrwały dyskomfort. Odczucia zależą między innymi od rodzaju wymazu i indywidualnej reakcji pacjenta.
Zwykle nie jest potrzebne szczególne przygotowanie, ale należy przestrzegać zaleceń punktu pobrań i laboratorium. Wymagania mogą się różnić w zależności od rodzaju próbki i zastosowanego testu. Warto też poinformować personel o okolicznościach, które mogą mieć znaczenie dla pobrania, i nie zmieniać samodzielnie zaleceń dotyczących przygotowania.
Co dzieje się z próbką w laboratorium?
Po dostarczeniu próbka jest przyjmowana i przygotowywana zgodnie z zasadami bezpieczeństwa biologicznego. Laboratorium izoluje z niej RNA, które stanowi materiał wyjściowy do reakcji. Jakość pobrania, czas transportu i warunki przechowywania mogą wpływać na ilość materiału dostępnego do analizy.
Do reakcji dodaje się między innymi startery, sondy fluorescencyjne, enzymy i odczynniki. Odwrotna transkryptaza przepisuje wirusowe RNA na DNA. Następnie kolejne cykle PCR powielają wybrane fragmenty materiału genetycznego. Jeśli badana sekwencja jest obecna, ilość produktu rośnie, a wraz z nią narasta sygnał fluorescencji rejestrowany przez aparat.
Parametry reakcji zależą od konkretnego protokołu. W jednym z opisów CDC reakcję prowadzono w objętości 20 µl, wykorzystując 5 µl wyizolowanego materiału genetycznego i 45 cykli amplifikacji. Są to dane dotyczące określonej procedury, a nie uniwersalny schemat dla każdego testu RT-PCR.
Laboratorium ocenia wynik w odniesieniu do kontroli dodatnich i ujemnych, a czasem również kontroli jakości próbki. Kontrola dodatnia pomaga sprawdzić, czy reakcja wykrywa oczekiwany materiał, natomiast ujemna może ujawnić zanieczyszczenie lub nieprawidłowy przebieg badania. Kontrola próbki pomaga ocenić, czy pobrany materiał nadaje się do interpretacji. Dzięki temu wynik nie jest oceniany wyłącznie na podstawie pojedynczego sygnału.
Ile trwa badanie i co wpływa na wiarygodność wyniku?
Niektóre laboratoryjne testy RT-PCR mogą dostarczyć wynik analizy w około 4-8 godzin. Nie oznacza to jednak, że pacjent zawsze otrzyma rezultat w tym czasie. Do całkowitego czasu oczekiwania dochodzą transport próbki, kolejka w laboratorium, organizacja pracy i raportowanie wyniku.
Szybkie testy molekularne mogą działać w krótszym czasie, ale nie należy utożsamiać ich z każdym standardowym badaniem RT-PCR. Dla wybranych szybkich testów molekularnych wykrywających grypę podawany czas wynosi około 15-30 minut. Ten zakres dotyczy określonych platform i nie powinien być przenoszony na laboratoryjne testy RT-PCR w ogólności.
Na wiarygodność wyniku wpływają czułość i konstrukcja testu, jakość próbki oraz moment jej pobrania. Niewłaściwe pobranie, opóźnienie w transporcie lub nieodpowiednie przechowywanie mogą obniżyć ilość materiału dostępnego do wykrycia. Dla niektórych próbek oddechowych przewidziano przechowywanie w temperaturze 2-8°C do 72 godzin. Przy dłuższym opóźnieniu w opisanych protokołach zaleca się zamrożenie próbki w temperaturze −70°C lub niższej. Warunki dla konkretnego materiału trzeba zawsze sprawdzić w obowiązującej procedurze.
Co oznacza dodatni lub ujemny wynik RT-PCR?
Wynik dodatni oznacza, że w badanej próbce wykryto sekwencję RNA będącą celem testu. Sam rezultat nie rozstrzyga jednak zawsze o zakaźności pacjenta ani o ciężkości choroby. Interpretacja powinna uwzględniać objawy, sytuację kliniczną oraz rodzaj i czas wykonania badania.
Wynik ujemny oznacza, że w dostarczonym materiale nie wykryto badanego celu. Nie wyklucza jednak całkowicie zakażenia. Wynik może być ujemny, jeśli próbkę pobrano zbyt wcześnie lub zbyt późno, pobranie było niewłaściwe albo w materiale znajdowała się zbyt mała ilość materiału genetycznego. Dlatego nie należy interpretować go w oderwaniu od objawów i prawdopodobieństwa zakażenia.
W przypadku wątpliwości znaczenie wyniku warto omówić z osobą wykonującą badanie lub pracownikiem ochrony zdrowia. Dalsze postępowanie zależy od sytuacji pacjenta i zaleceń klinicznych, a nie wyłącznie od samego odczytu aparatu.
Jak rozwijają się testy molekularne?
Jednym z kierunków rozwoju diagnostyki są testy wieloparametrowe, które w jednym badaniu wykrywają kilka celów genetycznych lub różnych patogenów. Takie podejście może ułatwić rozróżnianie zakażeń o podobnych objawach i ograniczyć potrzebę wykonywania kilku osobnych analiz. Równolegle rozwijane są szybsze platformy molekularne, pozwalające skrócić czas od pobrania materiału do uzyskania wyniku.
Nowe rozwiązania nie zmieniają podstawowej zasady interpretacji: trzeba uwzględnić rodzaj testu, jakość próbki, kontrole laboratoryjne i kontekst kliniczny. Krótszy czas analizy nie oznacza automatycznie, że każda platforma działa identycznie jak klasyczny laboratoryjny RT-PCR. Informacja o zastosowanej metodzie pomaga właściwie rozumieć zarówno możliwości badania, jak i ograniczenia jego wyniku.
Źródła
- https://extranet.who.int/prequal/sites/default/files/document_files/EUL_0486-139-00_SARS-CoV-2_Real-TimeMultiplexRT-PCR-Kit_PR_v2.0.pdf
- https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-for-detection-instructions.pdf
- https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/331501/WHO-COVID-19-laboratory-2020.5-eng.pdf
- https://stacks.cdc.gov/view/cdc/91572/cdc_91572_DS6.xml
- https://www.cdc.gov/flu/hcp/testing-methods/molecular-assays.html